建立PCR反應(yīng)體系時需注意的幾個問題

　　首先要說的是Taq酶，其特征是5`→3`DNA聚合酶活性，缺乏5`→3`核酸外切酶活性，在70-75攝氏度時活性較高。在典型的聚合酶鏈反應(yīng)中，當總反應(yīng)體積為100微升時，需要約2.5微升Taq酶。需要注意的是，使用的酶量太高，不會引起非特異性擴增，而當酶量太低時，合成產(chǎn)物的量會減少。

　　第二要注意的是dNTP的質(zhì)量和濃度。脫氧核糖核酸的質(zhì)量和濃度與聚合酶鏈反應(yīng)擴增效率密切相關(guān)。在PCR反應(yīng)中，dNTP一般應(yīng)為50 ~ 200 umol/L，濃度過低會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，dNTP可以與Mg2結(jié)合降低游離Mg2的濃度。四種dNTP的濃度應(yīng)該相等(如摩爾制劑)，如果其中任何一種不同于其他種類(高或低)，就會造成不匹配；dNTP保存不當，使其不穩(wěn)定，不活躍。少量包裝，在-20攝氏度冷凍。反復(fù)凍融會降解dNTPdNTP溶液呈酸性，應(yīng)配制成高濃度，然后用1M  NaOH或1M  Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)pH值至7.0 ~ 7.5。

　　第三、模板的數(shù)量。在一般的聚合酶鏈反應(yīng)擴增中，104到107個模板分子可以獲得滿意的結(jié)果。

　　第四、Mg2濃度，一般PCR反應(yīng)中，當各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2

　　濃度一般為1.5 ~ 2.0 mmol/L，Mg2濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異性擴增。濃度過低，Taq  DNA聚合酶活性降低，反應(yīng)產(chǎn)物減少。

　　后，引物是聚合酶鏈反應(yīng)特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的特異性取決于導(dǎo)入

　　DNA與模板的互補程度。為了保持尹武，的完整性，應(yīng)避免反復(fù)凍融。

　　當然要特別注意加入的水，一個是ph，一個是純度。